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冷冻制样问题集锦

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发表于 2017-6-14 00:00:35 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 Somnus8805 于 2017-10-12 21:40 编辑

1.  图示中这样的grid改向什么方向优化啊,试了几种不同的glow时间,blot时间,样品load量,最后结果都差别不大。       样品为:膜蛋白,处于detergent里,用vitrobot冻的。



   出现原因:冰太薄,有detergent , blot的时候溶液跑得太快了,一下子就blot干了
   解决方法:1. 提高浓度,或者冰厚一些 或者冰的厚度均一点会好 (浓度大了 粘度也大 跑得慢)
                  2. 试试manual plunger吧(by 戴兴红-UCLA)
                  3. 增加蛋白浓度,或改变glow discharge 时间(唐麟 川大神经生物学)
                  4. 把样品滴上铜网后,在vitrobot里停留三十秒再吸水,可以尝试减短blot time,增加drain time【增加drain time会让冰变得更薄,所以drain time和blot time 一起尝试,而且vitrobot里湿度接近100%,drain time更多的是让液膜自适应,drain time是blot后的等待时间】(by 潘锡江-FEI)
                   5. 尝试降低blot time和force  或者试试小孔grid (by 柏林 Van Andel institute)



New idea need to discuss当液膜只有100nm左右厚度的时候,到底是蒸发快还是吸水快,说不清楚 (by 潘锡江-FEI)

New Question:不是说blot以后最好不要有停留 这样air water interface 蛋白容易unfold?
                        答:有detergent的时候,蛋白很难冒头啊,就看冰层厚度和蛋白性质了。

New Question:drain time高的话可以用到多少啊?
                          答:drain time从0.5s开始尝试,最多不超过2s。但是相应的blot time也要减少。【比如说4ul的样品,我设wait time 30s,blot force 0,blot time 3s,drain time 0.5s,以这个为起始点,修改blot time和drain time,其他两个可以不变。】


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